PCR擴(kuò)增試劑盒使用后可擴(kuò)增出多條DNA片段
瀏覽次數(shù):912發(fā)布日期:2021-08-19
PCR擴(kuò)增試劑盒是從克隆有ThermuaquaticusDNAPolymerase基因的大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后,再經(jīng)三次過柱純化分離出來的一個(gè)約94KD的重組蛋白。無外源核酸酶和細(xì)菌DNA污染,穩(wěn)定性好,特異性強(qiáng),適用于各種PCR擴(kuò)增。本試劑盒已經(jīng)包括了PCR擴(kuò)增使用的各種試劑,便于客戶配套使用。使用本制品擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物的3'端附有一個(gè)A堿基,因此可直接克隆于T-Vector中。
所謂多重PCR(MultiplexPolymeraseChainReaction,mPCR),也稱復(fù)合PCR,由Chambehian'在1988年提出(Chambehian'et.al.NucleicAcidsRes.1988Dec9;16(23):11141–11156.),基本原理與常規(guī)PCR相同,區(qū)別在于多重PCR的反應(yīng)體系是加入多對(duì)引物,各對(duì)引物分別結(jié)合在模板的相應(yīng)位置,擴(kuò)增出多條DNA片段。
PCR擴(kuò)增試劑盒實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):
1.進(jìn)行PCR反應(yīng)前,可以將所有g(shù)DNA的濃度稀釋到同一濃度,并轉(zhuǎn)移到PCR8聯(lián)管中,一方面是便于排槍操作,另一方面是加入相同起始量的gDNA,這樣可以降低文庫的濃度差異,便于混合文庫。
2.大多數(shù)情況下引物是1管,操作相當(dāng)方便;當(dāng)目標(biāo)區(qū)域是外顯子或者是其他連續(xù)區(qū)域時(shí),我們會(huì)把引物分裝為2管,分別命名PrimerpoolT1與PrimerpoolT2,這時(shí)需要第二輪PCR前把產(chǎn)物合并,再進(jìn)行下一步反應(yīng)。
3.執(zhí)行多重PCR反應(yīng)時(shí),特別是樣本量多的情況下,可以將T1設(shè)為一組,T2設(shè)為一組,便于制備反應(yīng)試劑混合液和排槍操作;并把解凍好的試劑放置在冰盒上,在冰盒上進(jìn)行加樣操作。
4.在實(shí)驗(yàn)中,可以在PCR管壁上和管蓋上同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)編號(hào)標(biāo)記,防止高溫或其他原因?qū)е掠浱?hào)消失,避免后續(xù)產(chǎn)物混合操作失誤,造成樣本交叉污染。
5.第二輪PCR后,因?yàn)閅FBufferB試劑比較粘稠,在清洗純化的時(shí)候不能吸走所有試劑,可以剩余5-10μl,否則會(huì)把磁珠一起吸走,造成樣品的損失,導(dǎo)致產(chǎn)物回收率下降。